ملاحظات کلیدی طراحی برای پروتکل های مطالعه اعتبار سنجی پاکسازی ویروسی محصولات ژن درمانی

ICH Q5A(R2){2}}بنیاد هماهنگ سازی بین المللی

ICH Q5A(R2) به طور رسمی در 1 نوامبر 2023 به تصویب رسید و نشان دهنده اصلی سند راهنمایی بین المللی برای ارزیابی ایمنی ویروسی است. در مقایسه با Q5A(R1) منتشر شده در سال 1999، به روز رسانی های قابل توجه در نسخه R2 عبارتند از: یک فصل جدید اضافه شده در ارزیابی ایمنی ویروسی در تولید مداوم (فصل 7). نقش تقویت شده ارزیابی ریسک به عنوان پایه و اساس استراتژی های پاکسازی ویروسی. ادغام توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) در ملاحظات تشخیص ویروس؛ و الزامات صریح برای ارزیابی محصولات جدید و فرآیندهای تولید. Q5A(R2) توسط مقامات نظارتی از جمله FDA، EMA و PMDA پذیرفته شده است و یک چارچوب فنی یکپارچه برای اعتبار سنجی پاکسازی ویروس در سراسر جهان ارائه می کند.

NMPA{0}}سیستم نظارتی چین

چارچوب نظارتی NMPA برای ایمنی ویروسی سطوح مختلفی را پوشش می دهد:

سطح سند	نام سند	سال صدور
سند بنیادی	دستورالعمل های فنی برای حذف/غیرفعال کردن ویروس ها از فرآورده های خونی	2002
سند بنیادی	اصول کلی برای بررسی فنی ارزیابی ایمنی ویروسی بافت بیولوژیکی-محصولات مشتق شده و سلول یوکاریوتی{1}}محصولات بیان شده	2005
دستورالعمل خاص محصول-	دستورالعمل‌های فنی برای تحقیقات دارویی و ارزیابی کاربردهای کارآزمایی بالینی برای ناقل آدنو نوترکیب-ویروس مرتبط (rAAV)-بر اساس محصولات ژن درمانی In Vivo	2023
دستورالعمل خاص محصول-	الزامات فنی رایج برای کیفیت دارویی ناقل آدنو{0}ویروس مرتبط (rAAV) نوترکیب-بر اساس محصولات ژن درمانی In Vivo برای برنامه‌های مجوز بازاریابی	2025
دستورالعمل نوآورانه	دستورالعمل‌های فنی برای اعتبارسنجی پلت فرم فرآیندهای پاکسازی ویروسی برای کاربردهای آزمایشی بالینی محصولات پروتئین نوترکیب درمانی (آزمایشی)a	2024

الف: این دستورالعمل نشان دهنده اولین باری است که مقام نظارتی چین الزامات فنی سیستماتیک را برای اعتبارسنجی پلت فرم فرآیندهای پاکسازی ویروسی تعیین کرده است و با روح ICH Q5A(R2) همسو می شود.

FDA و EMA{0}}الزامات نظارتی ایالات متحده و اروپا

FDA به طور رسمی یک سند راهنمای صنعت بر اساس ICH Q5A(R2) در ژانویه 2024 صادر کرد. علاوه بر این، فصل داروسازی ایالات متحده (USP)<1050.1>راهنمایی های فنی تکمیلی در مورد طراحی، ارزیابی و توصیف روش های پاکسازی ویروسی ارائه می دهد. FDA هر دو سال یک بار سمپوزیوم پاکسازی ویروسی را سازماندهی می کند. سمپوزیوم 2023 به موضوعات پیشرفته‌ای مانند روش‌های جدید، ساخت مداوم، رسانه‌های کروماتوگرافی جدید، و فیلترهای جذبی پرداخت. اسناد راهنمایی اصلی EMA عبارتند از CPMP/BWP/268/95 (یادداشت برای راهنمایی در مورد مطالعات اعتبار سنجی ویروس: طراحی، مشارکت و تفسیر مطالعات اعتبار سنجی غیرفعال سازی و حذف ویروس ها) و EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 Virus Validation of Everestationaluationalu. محصولات دارویی)، که هر دو با ICH Q5A(R2) هماهنگ شده اند.

شناسایی منابع آلودگی ویروسی

ICH Q5A(R2) تاکید می کند که طراحی اعتبار سنجی پاکسازی ویروسی باید بر اساس ارزیابی ریسک جامع باشد. برای محصولات ژن درمانی، شناسایی منابع آلودگی ویروسی باید سطوح زیر را بررسی کند:

سطح بانک سلولی: ویروس های درون زا (به عنوان مثال، ذرات رتروویروسی) و ویروس های نهفته عفونی که به طور بالقوه در بسترهای سلولی تولید می شوند (مانند HEK293، CHO، HeLa). سلول‌های HEK293 حاوی توالی‌های Ad5 E1 درون‌زا و یک قطعه تقریباً 900 جفت باز EBV هستند و قادر به بیان آدنوویروس{10}قابلیت تکثیر هستند. بنابراین، در ارزیابی ریسک باید به این ریسک توجه ویژه ای شود.

سطح ویروس کمکی: تولید ناقل AAV معمولاً از روش‌هایی مانند ترانسفکشن سه‌گانه با استفاده از پلاسمیدهای کمکی استفاده می‌کند، که خطر ایجاد تکثیر-آدنوویروس شایسته (RCA) را به همراه دارد. به طور مشابه، سلول‌های بسته‌بندی که در تولید ناقل لنتی ویروسی استفاده می‌شوند، ممکن است-لنتی‌ویروس شایسته (RCL) همانندسازی کنند.

سطح مواد خام: ویروس‌های ناخواسته ممکن است از طریق مواد خام مورد استفاده در تولید، از جمله محیط‌های کشت سلولی، خوراک‌ها و آنزیم‌ها معرفی شوند. این خطر به ویژه هنگامی که از ترکیبات مشتق شده از حیوانات استفاده می شود (مثلاً سرم جنین گاو، محلول های هضم تریپسین) قابل توجه است.

تفاوت های خطر: ژن درمانی در مقابل پروتئین های نوترکیب سنتی

بعد ریسک	محصولات پروتئین نوترکیب سنتی	محصولات ژن درمانی
منبع ویروسی	ویروس های درون زا از بانک سلولی؛ ویروس های ناخواسته	ویروس های بانک سلولی؛ ویروس های کمکی؛ تکرار-بردارهای شایسته (RCV/RCL); ادغام ژنوم میزبان
بستر سلولی	CHO، NS0، Sp2/0 و سایر رده‌های سلولی به خوبی مشخص-	HEK293، HeLa، CHO، و غیره؛ برخی از رده های سلولی منشأ تومورزایی دارند
ویژگی های محصول	داروی مبتنی بر پروتئین-. ساختار خوب-تعریف شده است	ناقل ویروسی؛ خطرات ایمنی زیستی را به همراه دارد
استراتژی اعتبار سنجی	پاکسازی ویروسی چند مرحله ای؛ تاکید بر اعتبار سنجی مرحله فرآیند	تشخیص RCV/RCL مورد نیاز است. اعتبارسنجی و آزمایش هر دو ضروری است
اعتبار سنجی پلتفرم	قابل استفاده برای فرآیندهای ثابت مانند S/D، pH پایین، نانوفیلتراسیون	کاربرد محدود به دلیل تنوع انواع بردار

جدول 1. مقایسه خطرات ایمنی ویروسی: محصولات ژن درمانی در مقابل محصولات پروتئین نوترکیب سنتی

اصول کلی

انتخاب ویروس شاخص یک عنصر مرکزی در طراحی پروتکل های اعتبار سنجی پاکسازی ویروسی است. ICH Q5A(R2) مستلزم آن است که انتخاب ویروس شاخص بر اساس ارزیابی خطر باشد و عوامل زیر را در نظر بگیرد:

ارتباط ویروس با بستر سلولی تولیدی (ویروس مربوطه)

ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی ویروس (پوشش‌دار/بدون پوشش، DNA/RNA، محدوده اندازه)

مقاومت ویروس در برابر درمان های فیزیکی/شیمیایی

قابلیت شناسایی و ایمنی زیستی ویروس

برای محصولات ژن درمانی، انتخاب ویروس شاخص باید علاوه بر این در نظر گرفته شود: نقش خود ویروس ناقل به عنوان یک "ویروس مربوطه". خطر بالقوه آلودگی ویروس کمکی؛ و الزامات شناسایی و اعتبارسنجی برای تکثیر-ویروس‌های شایسته (RCV/RCL).

پنل ویروس نشانگر توصیه شده

ویروس	تایپ کنید	پاکت نامه	ژنوم	اندازه (nm)	منطق انتخاب / کاربرد
MVM	پاروویروس	هیچ کدام	ssDNA	18–26	مدل بدون پوشش- کوچکترین اندازه و بالاترین مقاومت؛ مناسب برای اعتبارسنجی نانوفیلتراسیون (به طور کلی برای محصولات بردار rAAV قابل استفاده نیست)
PPV	پاروویروس	هیچ کدام	ssDNA	18–26	مدل بدون پوشش- ویروس شاخص که معمولا برای فرآورده های خونی استفاده می شود
Reo-3	Reovirus	هیچ کدام	dsRNA	60–80	مدل بدون پوشش- اندازه متوسط؛ ثبات فیزیکی بالا
PRV	هرپس ویرید	بله	dsDNA	150–200	مدل پاکت دار; اندازه بزرگ؛ دامنه میزبان گسترده
X{0}}MuLV	رتروویروس	بله	ssRNA	80–110	مدل رتروویروس پوششی؛ مناسب برای بسترهای سلولی مشتق از CHO{0}}
BVDV	Flaviviridae	بله	ssRNA	40–60	مدل پاکت دار; برای ارزیابی روش های غیرفعال سازی شیمیایی (جانشین HCV) استفاده می شود.
VSV	Rhabdoviridae	بله	ssRNA	70	مدل پاکت دار; تحمل pH گسترده؛ مناسب برای اعتبار سنجی غیرفعال کردن pH پایین-

جدول 2. پنل ویروسی شاخص توصیه شده برای اعتبار سنجی پاکسازی ویروسی محصولات ژن درمانی

ملاحظات ویژه برای محصولات AAV Vector

برای محصولات ناقل AAV نوترکیب، دستورالعمل‌های فنی NMPA برای تحقیقات دارویی و ارزیابی کاربردهای کارآزمایی بالینی برای بردار rAAV{0}}بر اساس محصولات ژن درمانی In Vivo، نیازمند توجه به تشخیص تکرار-AAV صالح (rcAAV) است. rcAAV به AAV با قابلیت تکثیر مستقل اشاره دارد که معمولاً از نوترکیبی همولوگ بین پلاسمید کمکی و ژنوم محصول AAV ناشی می‌شود. تشخیص rcAAV به طور کلی با استفاده از روش‌های عفونی یا qPCR انجام می‌شود که به طور جداگانه روی ماده دارویی و محصول خالص‌سازی شده انجام می‌شود.

شایان ذکر است که فرآیندهای تصفیه پایین دستی برای محصولات ناقل AAV معمولاً شامل هضم نوکلئاز، کروماتوگرافی (AEX)، نانوفیلتراسیون و کروماتوگرافی تبادل یونی (CEX/IEX) است. در اعتبار سنجی پاکسازی ویروسی سنتی، این مراحل فرآیند ممکن است منجر به تلفات قابل توجهی از خود بردار AAV شود. بنابراین، تعامل بین ویروس‌های بردار و نشانگر باید در طراحی مدل کوچک-به دقت در نظر گرفته شود. برای مراحل خاص فرآیند (مثلاً نانوفیلتراسیون) که در آن تلفات بردار AAV قابل توجه است، باید ارزیابی شود که آیا تنظیمات فرآیند بر اساس داده‌های اعتبارسنجی (مثلاً تنظیم اندازه منافذ غشای نانوفیلتراسیون) تضمین شده است یا خیر.

اصول کلی

مقیاس{0}}مدل پایین (SDM) ابزار اصلی برای اعتبارسنجی پاکسازی ویروسی است. طراحی آن باید به طور دقیق عملکرد پاکسازی ویروسی فرآیند تولید را نشان دهد. ICH Q5A(R2)، بخش 6.2.2، صراحتاً ایجاب می‌کند که{5} مدل مقیاس پایین با فرآیند تولید در پارامترهای کلیدی سازگاری داشته باشد. برای محصولات ژن درمانی، ملاحظات زیر به ویژه در طراحی SDM مهم است:

نمایندگی پارامترهای فرآیند بحرانی

مدل کاهش مقیاس-باید با فرآیند تولید در پارامترهای زیر سازگار باشد: شرایط کروماتوگرافی (ترکیب بافر، pH، هدایت). نسبت بارگذاری (نسبت جرم پروتئین بردار/روی‌نبات)؛ زمان تماس و درجه حرارت؛ سرعت جریان/زمان اقامت؛ خلوص و ترکیب محصول برای محصولات AAV، تأثیر توزیع اندازه ذرات برداری و محتوای کپسید خالی بر عملکرد نانوفیلتراسیون نیز باید به طور خاص مورد توجه قرار گیرد.

شرایط صلاحیت مدل

ICH Q5A(R2) به صلاحیت کافی برای مدل پایین-مقیاس نیاز دارد، از جمله: مقایسه ویژگی‌های کیفیت محصول (مانند خلوص، بازیابی، تراکم). صلاحیت سازگاری پارامترهای فرآیند بحرانی؛ و حصول اطمینان از مقیاس{5}}مدل پایین، تنوع فرآیند فرآیند تولید را نشان می‌دهد. برای مراحل کروماتوگرافی، قوام مشخصات پیک، شستشو و شستشو باید واجد شرایط باشد. برای مراحل نانوفیلتراسیون، اثرات ظرفیت حجمی و ترکیب محصول باید تایید شود.

فرمول محاسبه LRV

مقدار کاهش ورود به سیستم (LRV) معیار اصلی برای اندازه‌گیری اثر پاکسازی ویروس است. ICH Q5A(R2)، بخش 6.5، شرح مفصلی از روش های محاسبه LRV و درمان آماری ارائه می دهد. فرمول اصلی محاسبه LRV این است: LRV=log10(N0/N)، که در آن N₀ تیتر اولیه ویروس پس از اسپک شدن ویروس و N تیتر ویروس باقی مانده پس از درمان فرآیند است. هنگامی که تیتر ویروس باقیمانده از حد تشخیص سنجش پایین می‌آید، باید از روش‌های تخمینی مانند توزیع پواسون استفاده شود (مثلاً آزمایش حجم- بزرگ).

استفاده از فواصل اطمینان

هر دو ICH Q5A(R2) و EMA CPMP/BWP/268/95 نیاز به ارزیابی فاصله اطمینان نتایج محاسبه LRV دارند. معمولاً یک فاصله اطمینان 95٪ اعمال می شود.

معیارهای اثربخشی

طبق دستورالعمل‌های فنی NMPA برای حذف/غیرفعال‌سازی ویروس‌ها از فرآورده‌های خونی، کاهش ویروس بیشتر از یا مساوی 4 گزارش نشان می‌دهد که مرحله فرآیند برای حذف/غیرفعال‌سازی ویروس مؤثر است. با این حال، این معیار یک آستانه مطلق نیست و باید به روشی جامع همراه با منحنی‌های سینتیک غیرفعال‌سازی، منطق علمی برای انتخاب ویروس شاخص و استحکام کلی طراحی پروتکل اعتبارسنجی ارزیابی شود. برای محصولات ژن درمانی، باید توجه ویژه ای به ظرفیت پاکسازی تجمعی در تمام مراحل فرآیند شود تا اطمینان حاصل شود که مشخصات کلی ایمنی ویروسی در سطح قابل قبولی است.

کاربرد و چالش های نانوفیلتراسیون

فیلتراسیون نگهدارنده ویروس (نانو فیلتراسیون) یک مرحله پاکسازی ویروسی مهم در تصفیه پایین دستی محصولات ژن درمانی است. فیلترهای نگهدارنده ویروس معمولی دارای اندازه منافذ تقریباً 20 نانومتر هستند. مکانیسم پاکسازی ویروسی نانوفیلتراسیون اساساً بر اساس اندازه- حذف است، و می‌تواند به طور مؤثر اکثر ویروس‌های بزرگ‌تر از اندازه منافذ غشاء، از جمله پاروویروس‌های کوچک بدون پوشش مانند MVM و PPV را حذف کند.

با این حال، نانوفیلتراسیون برای محصولات ژن درمانی با چالش های منحصر به فردی مواجه است: اندازه وکتورهای AAV (تقریباً 20-26 نانومتر) شبیه به ویروس های شاخص خاصی است (مانند MVM، 18-26 نانومتر)، که ممکن است منجر به کاهش بازیابی ناقل شود. کپسیدهای خالی ممکن است بر شار فیلتراسیون و کارایی حفظ ویروس تأثیر بگذارد. ویسکوزیته نمونه ممکن است با غلظت بردار به طور قابل توجهی افزایش یابد. بنابراین، طراحی SDM برای اعتبارسنجی نانوفیلتراسیون باید به طور کامل اثرات توزیع اندازه ذرات برداری و محتوای کپسید خالی را بر عملکرد فیلتراسیون در نظر بگیرد، و در صورت لزوم باید به استفاده از غشاهای نانوفیلتراسیون با اندازه منافذ بزرگ‌تر توجه شود.

ارزیابی پاکسازی ویروسی مراحل کروماتوگرافی

کروماتوگرافی تبادل یونی (IEX) یک مرحله اصلی در فرآیندهای خالص سازی محصول AAV است که معمولاً از هضم نوکلئاز و سپس کروماتوگرافی تبادل آنیونی (AEX) برای گرفتن کپسیدهای خالی و معیوب یا کروماتوگرافی تبادل کاتیونی (CEX) برای خالص سازی دقیق کپسیدهای کامل استفاده می کند. مکانیسم های پاکسازی ویروسی در مراحل کروماتوگرافی شامل حذف اندازه، برهمکنش های الکترواستاتیکی، برهمکنش های میل ترکیبی و عوامل دیگر است. بحث در سمپوزیوم پاکسازی ویروسی FDA 2023 نشان داد که اثربخشی پاکسازی ویروسی مراحل کروماتوگرافی تحت تأثیر عوامل متعددی از جمله ظرفیت بارگذاری، pH، هدایت، و چرخه رزین است. برای ارزیابی جامع باید یک رویکرد طراحی متعامد چند عاملی- اتخاذ شود.

کنترل ایمنی ویروسی در تولید مستمر

فصل 7 تازه اضافه شده ICH Q5A(R2) الزامات خاصی را برای ارزیابی ایمنی ویروسی در تولید مداوم تعیین می کند. برای محصولات ژن درمانی، تولید مستمر به یک جهت توسعه مهم تبدیل شده است، اما چالش های جدید ایمنی ویروسی را نیز معرفی می کند. استراتژی‌های کنترل ایمنی ویروسی در تولید مستمر عبارتند از: فیلترهای مانع ویروس در خط به‌عنوان اقدامات مهم مهار. طراحی مناسب زمان سکونت و جریان فرآیند؛ ادغام مراحل غیرفعال سازی با زمان های نگهداری مشخص. و کاربرد پیشرفته فناوری تحلیل فرآیند (PAT) برای نظارت{6}}زمان واقعی پارامترهای فرآیند حیاتی.